柱层析法去除单克隆抗体中的病毒

前言

哺乳动物细胞（如 CHO 细胞）中产生的治疗性单克隆抗体（mAb）和 Fc 融合蛋白（本文中称为 mAb），往往存在病毒污染的潜在风险。下游纯化工艺除了要去除目标抗体外的其他杂质外，还需对潜在的内源性和外源性病毒进行有效的清除（去除或灭活）。层析法、病毒灭活和纳滤三个步骤相结合通常可有效的清除病毒。而层析法中，ProteinA 层析和精纯层析步骤都可以在一定程度上去除病毒。

病毒清除研究主要采用缩小模型柱进行，通常是在层析柱中加载病毒，通过初始加载的病毒量与层析后样品中的病毒量计算病毒清除率（LRV，通常用对数减少值表示），LRV越大则清除效果越好。整个纯化过程的病毒清除率是所有单元操作的病毒清除率的加和。早期阶段，病毒清除研究通常使用异嗜性鼠白血病病毒（X－MuLV）和小鼠细小病毒（MVM），两种病毒的相关信息见表1。研究发现，病毒的清除不仅受层析的条件的影响，还与目标 mAb 自身性质有关。

本文综述了常用柱层析的病毒清除能力，同时关注了病毒－mAb的相互作用对病毒清除的干扰。并简要讨论了使用病毒替代物作为活病毒的安全替代品评估病毒清除率的潜力。

表 1 早期病毒清除研究使用的两种病毒：X－MuLV 和 MVM

ProteinA 层析

ProteinA层析广泛用于mAb的捕获和初步纯化，对mAb具有高选择性，通常不截留病毒，因此猜测LRV会很高。但研究表明ProteinA层析病毒清除率反而较低（X－MuLV和MVM的平均LRV分别为2．98和2．32），且不同mAb的病毒清除率变异性高。当工艺和mAb固定时，LRV具有高度可重复性，上样浓度、流速、洗脱缓冲液摩尔浓度、洗脱 pH 和收集标准等几个参数均不影响病毒清除率。同时，X－MuLV和MVM的去除存在正相关性，当工艺和mAb固定时，当X－MuLV清除率高时，MVM 清除率也高。

Bach和Connell－Crowley对ProteinA层析清除 X－MuLV 的研究很好的解释了 ProteinA层析在病毒清除时的可重现性及高变异性。通过在层析柱上加载不同的样品，LRV 从大到小依次是：仅含X－MuLV的溶液＞除去抗体的细胞收获液＞含有抗体的细胞收获液≈纯化的mAb溶液。表明ProteinA层析中，mAb是决定LRV的主要因素，猜测比预期LRV低可能是由于病毒与mAb间存在相互作用，使其共同洗脱（图 1）。

在洗脱液中增加有干扰相互作用的添加剂（如氯化钠（1M）、精氨酸（750mM）、Triton（0．1％）和尿素（3M））可改善LRV，表明病毒－mAb间可能存在静电、疏水或氢键等相互作用。由于X－MuLV尺寸相对较大（80－110nm）而仅主要结合在树脂表面（ProteinA填料孔径范为100－130nm），MVM因尺寸较小（18－24nm），可进入填料孔隙而与更多的mAb分子相互作用，因此LRV较低。

图 1 ProteinA层析中病毒－mAb相互作用示意图：大多数病毒在上样过程中流穿，但有一小部分病毒因与mAb的相互作用被截留，而后随样品洗脱。

阴离子层析：AEX

多数mAb的等电点（pI）高于模型病毒的等电点，因此AEX通常采用流穿模式进行病毒清除研究，即mAb流穿而等电点低的病毒结合在树脂中。流穿模式下，AEX可有效去除包膜和非包膜病毒（X－MuLV和MVM的平均LRV分别为4．22和3．25）。由于病毒与AEX树脂间的静电作用，通常盐浓度越低，LRV越高。

研究表明，在低盐条件下，X－MuLV的LRV基本不受 pH（5．0－8．0）的影响，这与当 pH 为5时病毒应与AEX树脂结合的推理不符（X－MuLV的pI为5．8），推测该病毒在其表面上含有恒定的带负电荷的区域。虽然 MVM的LRV随着pH的增加而增加，但其在低于等电点的条件下清除效果低于预期。可见pI参数不足以预测作为病毒的大型复杂结构与离子交换（IEX）树脂的相互作用，更关键的是病毒表面电荷分布。AEX色谱法在较宽的参数范围内对病毒清除的稳健性较好，一般来说，建议使用 pH7．0–8．5、电导率＜14mS／cm 和载量＜100mg／mL。

虽然 AEX 在病毒清除时稳健性较好，但在推荐的条件下，仍会观察到某些 mAb 的LRV较低的现象。推测是病毒表面的负电荷与带正电荷的 mAb 相互作用，屏蔽了病毒表面的特征电荷，从而阻断了病毒与树脂结合，导致病毒与单克隆抗体共同流过（图 2）。病毒－mAb 相互作用的强度不仅取决于 mAb 的pI和操作pH，难以预测。与 ProteinA层析不同，带正电荷的AEX树脂与mAb竞争病毒结合，因此在 AEX层析中病毒－mAb相互作用对病毒清除的影响小于ProteinA层析。

图 2 AEX流穿模式中，大多数病毒在上样过程中与树脂结合，但有一小部分病毒表面电荷因病毒与mAb的相互作用被屏蔽，不与树脂结合而与 mAb 共流穿。

阳离子层析：CEX

CEX是另一种广泛用于精纯步骤的层析，与AEX统称为离子层析（IEX），通常采用结合－洗脱模式，通过线性或梯度性的增加盐浓度洗脱样品。Amgen公司研究表明，CEX可有效去除 X－MuLV、伪狂犬病病毒（PRV）和呼肠孤病毒3型病毒（Reo－3），但不能有效去除MVM。而操作pH是影响X－MuLV清除率的关键因素，pH5．0 时效果最好，当pH增加至5．5或6．0时，LRV明显降低， pH为6．5时几乎无任何效果。这表明pH值是决定单抗／病毒选择性的最关键因素。同时作者还证实了X－MuLV清除的主要机制是截留而不是失活即病毒在样品洗脱过程中与树脂结合。

也有研究表明病毒和树脂之间的静电相互作用在CEX介导的病毒去除中起主要作用。如AEX层析所示，mAb会流穿而大多数等电点低的病毒会与树脂强烈结合。但 CEX中，在pH5．0下，X－MuLV与CEX树脂的结合能力大于多数 mAb，而与其等电点相近的MVM却与CEX树脂没有明显的结合。猜测是X－MuLV中存在与CEX树脂产生相互作用的电荷簇，而MVM中没有。虽然机制尚不清楚，但pH5．0的条件下，CEX可有效和稳健的去除X－MuLV，且在此pH值下，病毒与CEX树脂的结合增强，有助于通过竞争性结合破坏潜在的病毒－mAb相互作用，进一步有利于病毒去除。

有研究人员考虑用CEX替代ProteinA层析进行病毒去除。在相似的条件下（即 pH5．0－5．7和电导率 3．0－6．0mS／cm），CEX在捕获步骤的病毒清除效果不如精纯步骤，但在一定的条件下可与 ProteinA层析相媲美。Connell－Crowley等研究表明，样品中HCP含量对精纯步骤CEX层析的X－MuLV去除几乎没有影响。用作精纯步骤样品的HCP含量（10－1850ppm）远低于细胞上清液中（高达 106ppm）。因此，当CEX层析用作捕获步骤时，样品中大量的HCP与病毒竞争结合树脂，从而导致病毒清除率下降。

CEX在过载模式下也可有效地去除X－MuLV。在过载模式下，层析柱的载量可以达到动态结合容量的10 倍。在这种模式下，mAb 可与紧密结合的杂质分离。在过载模式下，CEX层析对X－MuLV、Reo－3、PRV和MVM均有清除效果。同时，流速／停留时间对病毒去除效率有很大影响，流速增加，LRV 降低。并且过载模式下的CEX层析的病毒清除效果与结合－洗脱模式相当。

疏水层析（HIC）

除了IEX色谱法之外，基于疏水性分离蛋白质的HIC是另一种精纯步骤。HIC可以在结合洗脱或流穿模式下去除病毒，两种模式下病毒均是通过结合到树脂上而到达去除的目的，因此可选择有利于病毒结合的HIC工艺。当HIC树脂一定时，上样浓度、pH、线速度和电导率均会对病毒的清除有很大的影响。高电导率和低pH通常能增强病毒在HIC柱上的结合。高载量、高pH值、高流速和低电导率是往往是最不利于病毒去除。疏水性强的树脂病毒去除能力更强，但收率较低。因此，在选择HIC树脂时，需要平衡病毒清除率和产品回收率两个目标。除此之外，病毒的表面疏水性不同也是影响因素之一，如 HIC 对疏水性强的X－MuLV清除强于疏水性较低的MVM。

混合模式层析

混合模式树脂通常包含离子和疏水两种官能团。在低电导率和高电导率下，结合作用分别由电荷和疏水性主导。然而，结合作用通常不是两种作用的简单叠加，而是离子和疏水相互作用的协同。与单模式树脂相比，混合模式树脂通常在较宽的 pH 和电导率范围内均有较高的病毒清除率。如流穿模式下，当pH为 4．5－6．5，电导率为10－30mS／cm时，Capto adhere可有效的清除X－MuLV和MVM两种病毒。

羟基磷灰石（HA）是一种独特的混合模式树脂，包含CEX和金属亲和性双层特性。有研究表明，在6．7－7．8的pH条件下，HA层析对三种mAb中X－MuLV和PRV的清除率基本一致，而猿病毒40（SV40）的清除率因mAb不同而有所差异。分配研究表明，HA层析主要是通过上样过程和洗脱过程中病毒和树脂结合而清除病毒，且不同的mAb对同一病毒表现出不同的截留作用，表明病毒－mAb相互作用对于病毒的结合有影响。据报道，聚乙二醇（PEG）的添加可提高HA层析的病毒清除，其机制类似于聚集体的去除。

值得注意的是，混合模式层析在病毒去除方面是否可以直接等同于其他单模式层析（如IEX或HIC）取决于具体情况，难以一概而论。例如，一项研究表明，POROS HQ（AEX）和 Capto adhere（MIX）两种层析的X－MuLV清除率基本一致（两种树脂都含有季铵化聚乙烯亚胺基团）。而另一方面，POROS HQ 和 Capto adhere 的MVM清除率分别为 2．85 和＞6．8，因此混合模式层析的MVM清除率较高。

病毒替代物

病毒清除研究一般使用活病毒，由经过培训的人员在专业设施中实施，因此限制了在工艺开发过程中直接评估单元操作的病毒清除能力。因此更便宜和更安全的非感染性病毒替代物作为活病毒的替代品被开发出来，特别是MVM的主要衣壳蛋白重组表达产生的MVM的非感染性病毒样颗粒（VLPs），其与MVM有相似的物理化学性质（大小、表面电荷和疏水性），有望成为 MVM 的替代品。多数研究表明：这种MVM模拟病毒颗粒（MVP）在AEX，HIC及亲和层析上观察到的病毒清除率差异一致。

此外，MVP还可替代MVM研究病毒－mab的相互作用，主要采用交联层析法（cross－interaction chromatography），即通过交联将多个单抗单独固定在层析树脂上，然后将MVP和固定的单抗加入层析柱上，在不同的单抗偶联柱上MVP保留曲线不同，表明病毒与不同的单抗的相互作用不同。它证实了之前的结论，即病毒－mab相互作用在ProteinA层析清除病毒中发挥重要作用。

总结

不同的层析步骤往往表现出不同的病毒清除能力和稳健性，即使稳健的步骤（如AEX），mAb不同时也会观察到清除率的变化。ProteinA层析中病毒与mAb的相互作用影响病毒清除率，可添加破坏相互作用的两种或多种添加剂提高病毒清除率。除 ProteinA 层析外的步骤（如IEX、HIC 和混合模式），主要通过结合病毒实现清除，且选择有利于病毒与树脂结合的工艺条件通常会提高病毒清除率。同时这些步骤中的树脂与mAb竞争结合病毒，使得病毒－mAb 相互作用对病毒清除的影响小于 ProteinA层析。同时，病毒替代物的MVP的出现，不仅可以用于病毒清除研究，还可用于研究病毒－mAb之间的相互作用。

参考文献：

1．Li YiFeng． Viral removal by column chromatography in downstream processing of monoclonal antibodies［J］． Protein Expression and Purification， 198

原文标题:柱层析法去除单克隆抗体中的病毒