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光控RNA联合CRISPR-Cas技术，可时空精确操纵活细胞的RNA代谢与功能

时间：2022-04-02 12:18:03 来源：

文章背景简介

BACKGROUND INTRODUCTION

生物遗传中心法则是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译。RNA，特别是众多非编码RNA在多种细胞活动中发挥着重要作用。RNA能在细胞内的特定时间和位置表现出复杂的动力学和功能，这些动力学包括其表达、降解、易位、剪接和其他化学修饰的变化。

RNA结合蛋白（RBP）在RNA生物学功能发挥过程中承担着至关重要的作用。除了自然界存在RNA结合蛋白以外，人们还利用合成生物学原理将具有不同功能的结构域与RNA结合蛋白结合起来，合成了具有全新功能的RNA结合蛋白。然而，无论是自然界存在或者是人工合成的RNA结合蛋白，它们的活性很难被调控。因此，发展活性可控的RNA结合蛋白将有望实现对活细胞RNA的控制。

光是一个理想的触发器，因为它很容易获得，高度可调，无毒，最重要的是，具有高时空分辨率。在一些研究中，研究人员尝试通过使用紫外线控制RNA功能。从而实现了对基因表达、核酶活性、CRISPR－Cas功能和蛋白质－RNA交联的光学控制。然而，生物学家对这些方法的接受程度有限，这可能是因为紫外线辐射的毒性以及RNA合成相关的技术复杂性。RNA 功能可能由基因编码的光开关RBP进行光遗传学控制。光遗传学是一种新兴技术，基因编码的光开关蛋白具有灵活、高时空精度的特点。在真核细胞中，许多蛋白质被认为具有RBP的功能，它们控制着RNA代谢的几乎所有方面，包括转录、加工、翻译、周转和细胞定位。然而，关于天然光控制RBP的报道极为罕见。

2022年1月3日，华东理工大学Renmei Liu等在《Nature Biotechnology》（生物1区IF＝54．908）发表了题为“Optogenetic control of RNA function and metabolism using engineered light－switchable RNA－binding proteins ”的文章。该研究基于合成生物学及光遗传学原理并结合全新的高通量筛选策略成功构建了系列光控RNA效应因子，实现了动物细胞内RNA生成、剪接、运输、翻译、降解等代谢活动的时空精密控制。

所用到的主要方法

METHODS

1．蛋白质表达和纯化

2．光谱分析

3．分子排除色谱

4．细胞培养和转染

5．双分子荧光互补技术BiFC

6． RT－qPCR

文章主要内容摘要

ABSTRACT

RNA结合蛋白（RBP）在细胞环境调节RNA功能方面发挥着重要作用，但我们在时间和空间上控制RBP活性的能力是有限的。本实验中描述了LicV 工程，这是一种可光切换的RBP，它与特定的RNA序列结合以响应蓝光照射。当与各种RNA效应器融合时，LicV允许对细胞培养中的RNA定位、剪接、翻译和稳定性进行光遗传学控制。此外，LicV 辅助的CRISPR－Cas系统允许对转录和基因组位点标记进行有效和可调的光开关调节。这些数据表明，光可切换RBP LicV，从而可以作为可编程支架，用于合成RNA 效应器的时空控制。

本文中构建了国际上首个人工合成的光控RNA结合蛋白LicV，并将LicV与CRISPR－Cas系统结合起来，发展了全新的LA－CRISPR系统。