T细胞导向疗法中双抗的空间因素

前言

blinatumomab在治疗复发或难治性急性淋巴细胞白血病方面的成功，使基于双特异性抗体的T细胞导向疗法成为肿瘤免疫治疗药物开发的热点。

这种分子结构是通过与T细胞上的CD3和癌细胞上的肿瘤相关抗原（TAA）的相互作用来连接T细胞和肿瘤细胞。通过绕过MHC／TCR识别，这种方法能够在没有克隆限制的情况下诱导T细胞活化，并克服因为MHC表达下调产生的肿瘤免疫逃逸。

近年来，随着双抗表达和纯化技术的不断突破，双抗已经发展出近70种结构，而不同的结构产生不同的抗原识别臂距离。鉴于几何构型可能在形成免疫突触中起关键作用，通过构建两种不同形式的双特异性抗体模式：diabody FC（DbFc）和基于IgG的分子模式，研究发现拥有更长结合臂的IgG分子结构对膜近端的抗原表位更有效，而拥有较短结合臂的DbFc对对膜远端的抗原表位更有效。

双抗形式取决于作用目的

随着重组蛋白表达技术和抗体工程技术的发展，产生了许多不同的抗体形式。最佳的抗体结构取决于所期望的生物效应及其潜在的结构条件。多特异性抗体用于各种目的，包括受体激活、阻断、内化、聚集、膜相关蛋白的结合或细胞毒性效应细胞的定向靶点。

人工免疫突触的结构特征

抗原呈递细胞（APC）与T细胞之间的生理免疫突触（IS）是T细胞活化的关键。在T细胞膜上，IS显示为一个嵌套的环状结构，常被称为“bullseye”。中心区cSMAC（中央超分子激活簇）包含诸如T细胞受体（TCR）复合物、共刺激分子CD28、抑制免疫检查点（如PD－1或CTLA－4）、信号介质如Lck（淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶）和PKC（蛋白激酶C），以及穿孔素等细胞毒性分子。

cSMAC被周围的SMAC（pSMAC）包围，其中包含许多粘附分子，它们介导细胞－细胞的结合（如LFA1）。远端环（dSMAC）包括抑制性酪氨酸磷酸酶CD45和动态肌动蛋白。APC和T细胞之间的膜距离约为13–15nm。试验表明，一个拉长的膜间距降低了T细胞的活化，说明较近的距离是必须的，以适当地诱导T细胞活化。众所周知，BsAb通过同时结合靶细胞上的TCR亚单位CD3ε和TAA来促进规则的细胞溶解免疫突触的形成。人工免疫突触是一个高度组织化的结构，与生理拓扑结构具有相同的特征。肿瘤和T细胞之间的膜间距非常重要，因此，抗体尺寸是突触形成的一个关键参数。短结合臂对膜远端抗原更有效

为了比较不同双抗形式的结合臂与形成人工免疫突触诱导T细胞活化能力之间的关系，实验人员设计了一种新的双特异性diabody Fc（DbFc）格式，它采用了更紧凑的构型。与的基于IgG的分子形式相比，两个抗原识别臂之间的距离估计分别为3–6 nm和9–15 nm。

此外，为了系统地研究抗原表位位置在T细胞导向疗法中的作用，实验人员通过将表皮生长因子（EGF）样结构域作为相对刚性的结构间隔物，设计了一系列表达BCMA抗原的细胞系，这些细胞系以不同的EGF样结构域作为系链，以增加到靶细胞膜的距离。

研究发现，在24小时的效应器靶标比（E：T比）为5：1时，所有三种分子在诱导T0细胞系裂解方面表现出几乎相等的活性，T0细胞系在细胞表面呈现BCMA而没有任何栓系。随着到细胞表面的距离随着EGF样结构域数量的增加而增加，双特异性IgG2诱导T细胞定向裂解的能力迅速减弱，而Db和DbFc在细胞系T0到T5中显示出相当强的细胞毒性，T6和T7中的效力显著降低。

这说明双特异性抗体分子使T细胞与靶细胞接近的程度对免疫突触形成的效率有重要影响。全长IgG和Db衍生分子的差异可以用两个抗原结合位点的臂距来解释，因为Db和DbFc结构更为坚硬和紧凑，导致T细胞和抗原表达细胞之间的距离相对较短，当超过T细胞活化的距离阈值时，双抗的杀伤功能就会明显下降。

长结合臂对膜近端抗原更有效

然后实验人员检查了相反的情况，抗原表位位于膜的近端区域，并被其上不同数量的结构单元所掩盖。

于没有任何掩蔽的M0v细胞系，两种分子在15小时和24小时的时间点显示出几乎不可区分的EC50和Emax，24小时的数据清楚地显示出更高的最大杀伤率和显著的左移EC50。对于M2v和M4v，在15小时的时间点，DbFc活性明显低于基于IgG的分子。

然而，这两种分子的剂量－效应曲线在24小时时趋于一致，这个结果可能是由于T细胞活化的动力学差异导致，在足够长的时间内，EGF样结构域可能具有一定的结构灵活性，允许暴露膜近端BCMA抗原。对于M7v细胞系，即使在24小时，DbFc的Emax也稳定在约50％，低于基于IgG的分子，这表明在这种情况下，即使是柔韧性也不能克服空间位阻来补偿DbFc桥接CD3和BCMA的低概率。

靶向不同表位的双抗与体外活性的关系

为了深入了解表位位置如何影响双抗的细胞杀伤活性，实验人员在过度表达FLT3的EoL1急性髓系白血病（AML）细胞系上设计并研究了多种FLT3／ CD3双特异性抗体分子。FLT3是一种受体酪氨酸激酶，其胞外结构域由五个Ig样结构域组成。

结果显示，与一系列表达BCMA的工程细胞系的研究结果一致，针对FLT3不同结构域的双特异性分子显示出显著不同的细胞毒性，其受到分子形式的强烈影响。靶向膜远端结构域D1和D3的DbFc介导了比其IgG对应分子更有效的细胞毒性，可能是由于其使两个细胞膜紧密结合的能力。

另一方面，针对膜近端结构域D4和D5的IgG双特异性分子诱导特异性靶细胞裂解，而对于DbFc形式的相同抗FLT3抗体，在高达10 nM的浓度下未观察到显著的细胞毒性。

小结

通过使用两种形式（基于IgG和DbFc）的双抗，对抗原表位位置和双抗分子激活T细胞的体外效力之间的关系进行了研究。研究发现，当抗原表位位于膜远端区域时，DbFc形式更有效，而基于IgG的双特异性分子对于被其他结构域掩盖的膜近端表位更有效。

此外，在更具生物学相关性的背景下，针对FTL3抗原不同结构域的双特异性分子证实了这些发现。因此，在设计T细胞导向疗法的双抗分子时，除了考虑抗体的亲和力，分子形式，抗原特性之外，还需要注意不同双抗形式与抗原结合表位位置的关系。

参考文献：

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