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多光子显微镜成像技术之二十五紧凑型同步自发荧光多倍频显微镜技术

时间：2023-01-03 20:16:52 来源：

高帧率、高分辨、低光毒性的活体成像技术，能直接跟踪各种细胞间行为，对于生命活动的研究至关重要。无标记非线性光学显微术作为一种活体成像技术，以其非侵入性、高穿透深度、高分辨率等优点，成为神经科学、肿瘤学和免疫学研究的有力工具。

2018年，美国Boppart课题组提出了同步自发荧光多倍频显微镜技术（SLAM）：通过降低激光源的重复频率（10 MHz）、缩短脉冲宽度（＜60 fs）、调整中心波长至1110 nm，获得了相对较高的峰值功率，并可同时获取双光子荧光、三光子荧光、二倍频、三倍频（2PAF／3PAF／SHG／THG）四个模态的信号。然而，该系统仍然存在一些局限性：

1）高峰值功率导致系统中的光子晶体光纤（PCF）寿命较短（～200 小时），需要定期更换，系统操作复杂；

2）系统平均功率有限，不允许用户在很宽的范围内调整脉冲重复频率；

3）低重复频率令光电倍增管（PMT）需要每个像素均有大量激发脉冲以获得足够的信号，限制了成像速度；

4）系统中使用的元器件较多，系统体积庞大且复杂。

图1 紧凑型SLAM系统示意图

为此，该课题组发展了如图1所示的紧凑型SLAM，其激发光源的中心波长移动到商业上更加成熟的1030 nm。通过使用PCF和棱镜对压缩器，可获得从变换极限60 fs到未压缩300 fs可调脉宽的激发脉冲，重复频率在800 kHz－20 MHz可调，且具有足够的脉冲能量。

这三个脉冲参数（脉冲宽度、重复频率、脉冲能量）可以独立调节，互不干扰。这使用户能够找到适合不同应用的最佳成像条件，以最大限度地提高信噪比。因为新激发波长无需产生超连续谱，PCF承受的峰值功率较低，激光源可稳定工作超过1年，无需更换 PCF。

此外，如图2所示，该系统配备了五个检测通道，利用2PAF／3PAF／SHG／THG四种模态，可同时观测新鲜生物组织内的脂质、色氨酸、NADH、胶原纤维和FAD。

图2 紧凑型SLAM系统的五个探测通道

为验证此系统，该课题组对无标记小鼠组织进行了多模态成像，结果如图3所示：虚线框内的图像是小鼠皮肤内表面富含脂肪的区域。通过4个不同的光谱通道，可清晰反映4模态的丰富信息。

其中，通道1为反映NAD（P）H信息的3PAF信号（图3b），通道2为THG信号（图3c），通道3为SHG信号（图3d），通道4为反映 FAD 信息的 2PAF 信号（图3e）。THG 信号展现了清晰的脂肪细胞和细胞膜，SHG信号展现了丰富的纤维。4 种不同模态的合成图像则如图3a所示。

此外，图3f 和图3g分别对应每像素单脉冲和每像素20个脉冲的情况，比较两幅图像可以看出，每像素单脉冲的单帧成像能够以相对较低的信噪比揭示组织结构。如果配合高速扫描仪使用，该系统可以根据需要实现高帧率、无标记、长期并且非线性光损伤风险较低的成像。

图3 紧凑型SLAM对小鼠组织的成像结果

综上所述，本文构建了一个基于现成光学和机械组件的紧凑型 SLAM 系统［1］，该系统能够通过优化驱动光源参数提高单帧的信噪比，降低单像素停留时间或总平均帧数的要求，从而增加成像速度。脉冲重复频率、能量和脉冲宽度均可独立调节以满足不同应用。此外，激光开启后10分钟内即可用来驱动显微镜成像，且很容易补偿光纤耦合对准中的偶然漂移。最后，紧凑的设计允许将整个显微镜集成到可移动的推车中进行临床研究。

参考文献：

［1］． Geng Wang， Stephen A． Boppart， Haohua Tu． Compact simultaneous label－free autofluorescence multi－harmonic （SLAM） microscopy for user－friendly photodamage－monitored imaging． arXiv：2210．13556 （2022）．

原文标题:多光子显微镜成像技术之二十五紧凑型同步自发荧光多倍频显微镜技术

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