多光子显微成像技术之二十　基于复合探针的CARS内窥镜

相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微镜是进行光学活检来诊断肿瘤，以及对富含脂质的组织进行无标记成像的重要工具。目前标准内窥镜的直径太大，无法在敏感组织内使用。为了解决该问题，人们发展了基于多模光纤的CARS内窥镜：多模光纤具有高数值孔径 （NA） ，可以提供与其他内窥镜相当的图像质量，并且由于多模光纤只有100 ?m左右，可以在损伤较小的情况下在组织深处成像。但是，由于四波混频 （FWM） 和其他非线性过程，特别是在使用飞秒脉冲激发时，光纤内部会产生较强的背景信号，该背景信号与样品中产生的 CARS 信号在光谱上重叠，当同一根光纤同时用于激发和检测时，无法被滤除，从而大大降低图像对比度。

使用飞秒激光进行CARS内窥镜检查的理想多模光纤探针要满足两个条件。首先，要有足够高的带宽，使所有波长聚焦到同一时间和空间点。第二，光纤中产生的FWM背景应该尽可能低。第一个要求排除了使用阶跃折射率光纤（SI），因为SI光纤聚焦的位置严重依赖于波长，产生明显拉长的焦点，从而降低了通常与非线性成像相关的切片能力。相反，梯度折射率光纤（GRIN）有足够的带宽聚焦飞秒激光脉冲，但由于光纤的自成像特性，在样品平面上用来激发信号的聚焦点沿着探针多次重新成像，使得光纤内部产生了泵浦光和斯托克斯光束在时间和空间上完全重叠的高强度点，进而产生极强的FWM信号。

为了防止光纤内部形成致密的焦点，Pikálek等人将一小段SI光纤熔接GRIN光纤末端，设计了由GRIN光纤和SI光纤组成的复合探针［1］。

图1 用于光纤表征和成像的实验装置［1］

实验装置的原理如图1所示。首先1040 nm的斯托克斯光和800 nm泵浦光经SF57玻璃展宽，扩束准直后输入到空间光调制器（SLM），从SLM出射的±1级衍射进行偏振控制，之后依次经过二向色镜和耦合透镜将激发光输入到光纤内。激发光聚到样品表面，产生的信号可以前向探测（图中没画出），也可以进行后向探测。

此外，利用校正模块校准光纤输出端的模式，确保在多模光纤末端获得最佳焦点，如图1A所示。图1B展示了CARS的原理，通过改变泵浦光和斯托克斯光之间的时延调节拉曼位移。数值计算了GRIN光纤和复合光纤内部的光电场，如图１（C， D）所示，可以看出拼接一小段阶跃折射率光纤使得GRIN光纤输出端的场分布变为随机散斑模式，从而使自成像效应形成的焦点被分解成低强度焦点，而且由于阶跃折射率光纤的波长依赖性强，泵浦光和斯托克斯光的焦点在空间上较难重叠，导致FWM信号降低。图1E显示了小鼠大脑和探针的相对大小图，可以看出多模光纤尺寸较小，更适合于大脑内部成像。

图2 使用拼接和不拼接的多模光纤对荧光小球进行CARS成像［1］

作者使用三种不同光纤在未拼接和拼接1mm 阶跃折射率光纤时分别进行透射成像，可看出基于自制GRIN光纤或YOFC光纤的拼接探头能够有效抑制背景噪声，但是Prysmian光纤即使拼接，背景信号仍很强。因此，选择光纤时须谨慎。将图2A前两张图做差得到图2B，可以看出有明显的暗斑，说明不能通过简单的做差方式得到没有背景干扰的图像。图2C是后向探测得到的CARS图像，可以看出使用拼接方法也能有效抑制背景信号。之后，作者测量了不同拼接长度时的图像对比度，得到拼接长度约为1mm时，对比度最大，如图2D所示。

图3 组织成像［1］

此外，作者使用复合探针分别对小鼠的坐骨神经和大脑内部进行CARS图像，并对小脑的髓磷脂同时进行CARS成像和TPEF成像，证明了这种复合探针可以实现多模态成像，如图3所示。

综上所述，作者使用由GRIN光纤和阶跃折射率光纤拼接而成的复合探针，成功将非线性背景强度降低一个数量级以上，从而提高了CARS内窥镜的成像质量。

参考文献：

［1］ T． Pikálek， M． Stib?rek， S． Simpson， et al． Suppression of the non－linear background in a multimode fibre CARS endoscope． Biomed． Opt． Express 13， 862 （2022）．

原文标题:多光子显微成像技术之二十　基于复合探针的CARS内窥镜