CAR-T细胞治疗的挑战

化疗、放疗和外科手术是最传统的癌症治疗方法，但它们的疗效较低，副作用严重。因此，在过去的十年中，研究人员已经开发了新的策略，从而实现疾病的完全缓解。目前，免疫疗法已经成为革命性的癌症治疗方法，有几种类型的免疫疗法用于治疗癌症，其中包括过继细胞疗法（ACT）。

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法是一种ACT，自体T细胞通过基因工程表达CAR以特异性杀死肿瘤细胞。CAR－T细胞疗法是治疗对其他一线癌症治疗无反应患者的一个机会，并且已经在血液恶性肿瘤的治疗中展现出优越的抗肿瘤效果。然而，这类疗法作为一线临床治疗仍有许多挑战需要克服。从药学的角度来看，这项新兴技术仍然被归类为先进疗法，因此，要应用这项技术，必须首先满足医药监管的某些要求。因此，有必要分析CAR－T细胞技术的要素和挑战，并将基础、临床和实践等方面的因素考虑在内，采取应对策略，从而使CAR－T技术能够成为可负担的治疗模式。

CAR－T细胞发展简史

回顾CAR－T的发展史，首先要提到1957年Thomas及其同事报告的首次白血病患者骨髓移植以及随后Miller等人发现了T细胞的起源。然而，直到1986年Steven Rosenberg报告了一项关于肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的研究，这才让人们将目光锁定在“患者自身的免疫细胞可以对抗自身癌症”的理念上。

1992年，Sadelain等人成功地建立了逆转录病毒介导的基因转移到T淋巴细胞的方法，使基因修饰成为在实验或治疗环境中控制免疫的手段。几乎与此同时，ZeligEshhar及其同事利用抗体结合域和T细胞受体上免疫球蛋白的γ或ζ亚单位，通过嵌合单链设计了细胞毒性淋巴细胞的特异性激活，从而开发出第一代CAR－T细胞。

五年后，Sadelain博士的研究小组证明，将CD28等共刺激信号整合到CAR－T中可增强生存、增殖并保持活性，从而开发出第二代CAR。随后，携带靶向CD19的CAR－T细胞被开发出来，并启动了慢性淋巴细胞白血病（CLL）和急性淋巴细胞白血病（ALL）的I期临床试验。试验结果证明CAR－T疗法在化疗难治性ALL的成人中诱导有效缓解，随后生物工艺生产规模扩大。

2017年，FDA批准了CD19 CAR－T细胞疗法（Tisagenlecleucel）适用于儿童和年轻人的ALL。到目前为止，FDA批准了五种用于癌症治疗的CAR－T细胞治疗药物。

CAR－T细胞治疗的临床挑战

CAR－T细胞治疗面临的挑战，主要与副作用、毒性、T细胞耗竭和恶性肿瘤微环境（TME）有关。此外，在大规模生产中的制造过程目前既耗时又昂贵，因此，使尽可能多的患者接受CAR－T细胞免疫治疗成为一个更大的挑战。

副作用和毒性

在CAR－T细胞输注后，这种免疫疗法可能具有潜在的致命毒性。据报道，一些副作用包括发热、炎症、肝酶异常升高、呼吸困难、发冷、思维混乱、头晕、严重恶心、呕吐和腹泻。所有患者均有长期B细胞再生障碍，可通过服用丙种球蛋白缓解。毒性主要有两类：细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性（NTX）或CAR－T细胞相关脑病综合征（CRES）。

CRS或“细胞因子风暴”是一种全身炎症反应，由大量活化淋巴细胞（B细胞、T细胞和自然杀伤细胞）以及髓系细胞（巨噬细胞、树突状细胞和单核细胞）引起广泛的临床症状，包括发热、疲劳、头痛、皮疹、关节痛和肌痛。CRS是第一次输注CAR－T细胞后几天内发生的最常见的不良反应（85％的患者出现任何级别的CRS）。严重CRS病例以心动过速、低血压、肺水肿、心功能不全、高热、缺氧、肾损害、肝衰竭、凝血障碍和不可逆器官损害为特征。幸运的是，CRS的作用可以通过减少输注T细胞的数量和／或通过服用抗IL－6受体单克隆抗体和类固醇来缓解。

NTX是CAR－T细胞免疫治疗的另一常见并发症，发生在40％以上的患者中。通常出现在CAR－T细胞输注后的1至3周内，通常与CRS相关。患者表现出各种症状，如困惑、迟钝、震颤、谵妄、找词困难和头痛；其他症状，如失语症、颅神经异常和癫痫也有报道。

及时管理毒性对于降低与免疫治疗相关的死亡率至关重要，因此，研究人员制定了不同的安全策略来克服和预防CAR－T细胞毒性，如设计新一代的CAR。毒性管理已成为CAR－T细胞免疫治疗成功的关键步骤。

CAR－T细胞耗竭

尽管CAR－T细胞治疗完全缓解率高，然而大部分获得缓解的患者在几年内表现出疾病复发，B－ALL的复发率从21％到45％不等，并随着随访时间的延长而增加。治疗失败的部分原因是实体瘤产生的TME导致的CAR－T细胞耗竭。

CAR－T细胞耗竭是指一种功能障碍状态，其特征是由于持续的抗原刺激、CAR结构的共刺激域和抑制性受体的表达增加而导致抗原特异性T细胞的缺失。体外CAR－T细胞研究表明，在CAR－T细胞耗竭过程中，抑制性受体（如PD－1、Lag3、Tim3和TIGIT）的表达上调，以及通过CTLA－4抑制PI3K／AKT通路，是导致抗肿瘤功能丧失的主要原因。细胞因子在其中也起着重要作用，如耗竭的CAR－T细胞降低表达分泌IL－2、TNF－α和IFN－γ的能力此外。其他因素，如转录因子、代谢和表观遗传修饰，也在CAR－T细胞耗竭发展中发挥重要作用。

延迟耗竭的一种可能方法是构建抗耗竭的CAR－T细胞。最近的报告表明，某些转录因子如TOX和NR4A的发现，以及AP－1家族转录因子c－Jun的缺失或过度表达增加了CAR－T细胞对耗竭的抵抗力。最近，通过CAR－T细胞工程化（CRISPR／Cas9）敲除PD－1、或使用PD－1阻断抗体已被用于提高CAR－T治疗效果，避免耗竭。

肿瘤微环境

CAR T细胞免疫治疗在实体瘤中尚未取得成功。一个可能的原因是TME的免疫抑制性质影响过继免疫治疗的疗效。实体瘤存在高度浸润间质细胞，如癌相关成纤维细胞（CAF）和抑制性免疫细胞，包括髓源性抑制细胞（MDSCs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、肿瘤相关中性粒细胞（TAN）、肥大细胞，和调节性T细胞（Treg），它们有助于建立一种免疫抑制性TME，能够干扰CAR－T细胞疗法的疗效。

克服TME效应的策略包括使T细胞能够抵抗TME中的肿瘤抑制，例如显性负性受体或信号转换器的转基因表达，其可以将抑制信号转化为刺激信号。克服CAR－T细胞持续存在和耗竭的另一个机会是改善药物向肿瘤部位的转运。对于CAR－T细胞，局部注射是正在进行的一种尝试。

基因改变

一些报告显示使用CAR－T细胞治疗的患者缺乏疗效和复发存在基因改变。Orlando等人整合了全外显子组DNA－seq和RNA－seq，以研究CD19突变导致复发的程度。他们在12例患者样本中均发现了CD19基因第2–5外显子的新发基因改变，9例患者中的8例出现杂合性缺失，结论是CD19纯合子突变是获得性抗CAR－T细胞治疗的主要原因。

Asnani等人报告了类似的发现，他们描述了CAR－T细胞治疗后复发白血病患者外显子2和外显子5－6的跳跃。外显子2对CAR－T CD19表位的完整性至关重要，而外显子5－6负责CD19跨膜结构域。然而，需要进一步的研究来探索基因组分析的影响。

CAR－T细胞的制造工艺挑战

制造CAR－T细胞的传统技术包括：1）通过单采分离患者的T细胞（自体）；2）将回收的细胞运送到一个中心生产基地；3）对其进行基因改造以表达CAR；4）在实验室中进行扩增；5）将CAR－T细胞送回医院，注入患者体内。